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时间: 2020年04月04日 01:19 | 来源: 丿乱世丶名流站队 | 编辑: 公帅男 | 阅读: 8463 次

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2017 年 6 月 16 日,北京大学生命科学学院生物动态光学成像基地汤富酬课题组在《Cell Research》杂志在线宣布了题为 “Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells” 的研讨论文。在国际上首先开展了对一个单细胞一起进行染色质状况、DNA 甲基化、基因组拷贝数变异、以及染色体倍性的全基因组测序技能(single-cell COOL-seq),并选用这一技能在单细胞分辨率上体系、深化地解析了小鼠着床前胚胎发育进程中表观基因组重编程的要害特征,以及染色质状况与 DNA 甲基化之间的互动联系。

现有的依据高通量测序来剖析全基因组染色质状况的研讨办法通常需求很多细胞(例如 ATAC-seq、DNase-seq、FAIRE-seq、MNase-seq 等)。即便这些办法能够做到单细胞分辨率,也无法对同一个单细胞的各个表观基因组层面一起进行剖析,因此无法在单细胞分辨率上对多种组学之间的互动联系进行研讨。而汤富酬课题组将 NOMe-seq(全基因组核小体定位及 DNA 甲基化组测序)技能和 PBAT-seq 技能(全基因组重亚硫酸盐测序)奇妙地联系起来(图 1),并进行了体系的优化和进步,完结了对同一个单细胞进行多达 5 个层面(染色质状况、核小体定位、DNA 甲基化、基因组拷贝数变异和染色体倍性)的基因组和表观基因组特征的剖析。

图 1: single-cell COOL-seq 原理图

除了能够在单细胞水平上一起对多种组学进行剖析,与现有的剖析染色质状况的单细胞测序技能比较,scCOOL-seq 技能还具有如下长处:

(1)关于基因组中基地的功用元件区域具有很高的灵敏度和掩盖度。例如,关于小鼠胚胎干细胞系的一个单细胞,能够一起检查到 18,000 多个基因(一切已知基因的 75%)的发动子区域的染色质状况以及 DNA 甲基化水平, 也能够一起检查到 11,000 多个 CpG 岛(一切已知 CpG 岛的 70%)的染色质状况以及 DNA 甲基化水平;这为剖析干细胞分解发育进程中染色质状况的异质性以及 DNA 甲基化水平的异质性供给了强壮的东西。

(2)能够精准地判定出染色质的敞开状况和封闭状况,精确地把染色质封闭状况与因为技能因素未检查到的状况(假阴性)区别开来。现有的别的单细胞染色质状况测序技能(例如 scATAC-seq 和 scDNase-seq 技能)无法将染色质封闭状况和未检查到的状况(假阴性)区别开,这一缺点在现有技能的灵敏度比较低的状况下尤为严峻。而 scCOOL-seq 技能能够精确地区别染色质封闭状况(检查到了该基因组 DNA 片段,可是其间的 GpC 位点没有被甲基化)和因为技能因素未检查到的状况(没有检查到该基因组 DNA 片段)。这么对一种细胞类型中不一样的单个细胞之间同一个基因组区域的染色质敞开状况和封闭状况之间的份额能够给出精确的丈量成果,而不受检查灵敏度动摇的影响。

(3)能够对同一个 DNA 单分子一起取得其染色质状况和 DNA 甲基化的信息,使得这一技能不光具有单细胞分辨率,乃至到达了单分子分辨率,能够对同一个二倍体细胞的两个等位基因别离进行染色质状况和 DNA 甲基化的剖析。

(4)因为该办法一起扩增和测序敞开的和封闭的染色质区域,因此不受细胞中线粒体 DNA 含量动摇的影响。在细胞中线粒体 DNA 通常是环形暴露的 DNA,通常处于敞开状况。现有的别的单细胞染色质状况测序技能(例如 scATAC-seq 和 scDNase-seq 技能)因为只扩增和测序敞开的染色质区域,因此极大地受细胞中线粒体 DNA 含量的影响,特别是在着床前的前期胚胎细胞中线粒体 DNA 的含量是一般细胞的数十倍乃至数百倍,因此关于 scATAC-seq 和 scDNase-seq 等技能形成严峻影响。而 scCOOL-seq 技能因为一起扩增和测序敞开的和封闭的染色质区域而不受这一疑问的影响。

(5)因为掺入了 10% - 20% 的外源 lambda DNA,所以能够精确判别所剖析单个细胞所在的细胞周期期间以及染色体倍性。这关于精确剖析染色质状况和 DNA 甲基化与细胞周期以及染色体倍性的联系十分有协助。

考虑到多组学的信息量、有用数据量带来的昂扬测序本钱等疑问,关于细胞数量少,异质性强的着床前胚胎发育进程的研讨,scCOOL-seq 办法十分合适。该办法能够非常好地掩盖全基因组,有用地处理了如今 scATAC-seq 研讨中线粒体片段过度富集致使的有用数据量过少的疑问。一起,该办法能够一起剖析单个细胞中染色质敞开程度、核小体定位、DNA 甲基化、基因组拷贝数变异、以及染色体倍性这 5 个组学层面,关于难以很多取得的哺乳动物前期胚胎的发育、以及杂乱的癌症等疾病研讨,都将供给全部有用的处理方案。

在此根底上,该课题组运用这一新树立的 scCOOL-seq 办法,在单细胞分辨率体系地描写了小鼠着床前胚胎发育进程中表观基因组多个层面的动态改变。高度特化的精子和卵细胞联系后,会进行一系列杂乱、精确的染色质重塑进程,然后树立起前期胚胎发育的全能性和多能性。对该进程的解析将有利于大家了解细胞多能性树立进程中的表观遗传调控机制以及胚胎发育反常的分子机理,该项研讨发现:

(1)受精后 12 小时以内,来自高度特化的卵细胞和精子的男女原核就阅历了大规模的基因组去甲基化,父源基因组 DNA 甲基化程度从精子中的 80%(平均数)降低到雄原核中的 38%(p=1.4×10-11);一起母源基因组 DNA 甲基化程度从卵细胞中的 32% 降低到雌原核中的 28%(p=6.3×10-5)。在此进程中,爸爸妈妈源基因组的染色体状况敏捷翻开,在受精卵的原核期就现已到达高度敞开的状况,随后在受精卵晚期染色质敞开程度大幅度回落,并在 2 - 细胞期间以后敞开程度再次逐步添加,到囊胚期时到达最高点(图 2)。

图 2:小鼠着床前胚胎发育进程中基因组内源 DNA 甲基化(A)与染色质状况(B)以及染色质状况异质性(基因发动子区域;Homogeneously open、Divergent、Homogeneously closed 三种异质性状况)(C)(D)的动态改变

(2)初次在单细胞分辨率体系剖析了小鼠着床前胚胎发育进程中染色质状况的异质性。依据每个基因发动子区域在同一个发育期间不一样单细胞之间染色质状况的异质性,将小鼠的基因划分红均匀敞开(Homogeneously open)、敞开 / 封闭混合态(Divergent)、均匀封闭(Homogeneously closed)这三种状况。该研讨发如今受精后 12 个小时以内受精卵中大有些基因的发动子区域就由均匀封闭状况敏捷重编程为均匀敞开状况,为合子基因在随后的转录做好预备(图 2)。

(3)经过 RNA 聚合酶按捺剂按捺转录的试验,初次在单细胞分辨率证实持续转录关于保持基因发动子区域的染色质敞开状况具有主要作用。从受精前的卵细胞到受精后的晚期受精卵期间,发动子区大片段染色质敞开区域(长度大于 300bp)的数量大幅度添加。该研讨发现,运用 RNA 聚合酶按捺剂α-Amanitin 处理受精卵、按捺其转录活动,会致使数千个(56%)基因的发动子区大片段染色质敞开区域从头封闭,阐明持续的转录关于保持前期胚胎中大有些基因的发动子处于敞开状况是必需的,染色质状况敞开和转录活动互相促进,一起保持合子基因的安稳表达(图 3)。

(4)发现多能性基地因子 Oct4 的靶基因联系位点在 4 - 细胞期间就现已翻开并处于敞开状况,远早于真实树立多能性的囊胚期,暗示这些位点作为潜在的顺式调控元件也许参加了前期胚胎细胞的命运决议进程。

(5)初次在单个细胞内对爸爸妈妈源基因组的染色质状况以及 DNA 甲基化进行了深化剖析。从受精卵晚期到 4 细胞胚胎期间,在基因间区(intergenic region)父源基因组甲基化要显着高于母源基因组;而在基因区(gene body),父源基因组甲基化要显着低于母源基因组。这是因为在基因间区,父源基因组的去甲基化速度较慢;而在基因区,父源基因组的去甲基化速度要远快于母源基因组的去甲基化速度。更主要的是,关于基因区,胚胎期表达水平越高的基因其爸爸妈妈源基因组 DNA 甲基化的不对称性越激烈(表达水平越高,母源基因组甲基化就比父源基因组高越多)。与此相反,受精后爸爸妈妈源基因组的染色质状况就敏捷同步翻开,到受精后 12 小时,爸爸妈妈源基因组的染色质状况在每个单细胞中就现已到达一样的敞开状况,并在全部植入前期间保持这一爸爸妈妈源基因组之间染色质状况的精确平衡。这阐明受精后,染色质状况和 DNA 甲基化进行了不一样步的重编程进程,因为染色质状况关于合子基因的激活也许更主要,所以受精后爸爸妈妈源基因组的染色质状况敏捷重编程、在每个单细胞中敏捷到达精确平衡并一向保持。而 DNA 甲基化的重编程要慢一些并在爸爸妈妈源基因组之间保持不对称散布:在基因间区,父源基因组甲基化高于母源基因组;而在基因区,父源基因组甲基化低于母源基因组,而且与胚胎期基因表达水平有关(图 4)。

图 4:小鼠着床前胚胎发育进程中爸爸妈妈源基因组 DNA 甲基化的不对称散布

(6)初次在单细胞分辨率解析了雌性胚胎细胞中爸爸妈妈源 X 染色体的 DNA 甲基化和染色质状况重编程进程的异同。从配子到原核期受精卵,父源 X 染色体的 DNA 去甲基化速度显着比常染色体慢,而母源 X 染色体的 DNA 去甲基化速度和常染色体适当。从受精卵晚期到 4 细胞胚胎期间,父源 X 染色体的 DNA 甲基化显着高于母源 X 染色体,直到囊胚期,爸爸妈妈源 X 染色体的 DNA 甲基化水平才到达一起。这阐明受精以后,在雌性胚胎中失活的父源 X 染色体其 DNA 甲基化重编程速度要显着慢于活泼的母源 X 染色体。二者之间 DNA 甲基化的区别一向到囊胚晚期才逐步消除。受精后,雌性胚胎中爸爸妈妈源 X 染色体同步进行敏捷的染色质状况重编程,并在全部植入前期间保持这一爸爸妈妈源 X 染色体之间染色质状况的精确平衡。(图 5)。

图 5:小鼠着床前雌性胚胎单个细胞中爸爸妈妈源 X 染色体的 DNA 甲基化和染色质状况的动态改变

(7)初次在单细胞分辨率提醒了小鼠植入前胚胎发育进程中表观基因组的异质性。受精后,基因组中大有些基因的发动子区域在同一种细胞的不一样单个细胞之间保持着均匀的 DNA 甲基化和均匀的染色质敞开状况。有些基因发动子区域的 DNA 甲基化或染色质状况在同一个期间胚胎内不一样单个细胞之间具有激烈的异质性。但是,发动子区域 DNA 甲基化异质性激烈的基因和染色质状况异质性激烈的基因别离是两类不一样的基因。这暗示在小鼠着床前胚胎发育的进程中,染色质状况异质性和 DNA 甲基化异质性也许别离受不一样机制的调控。

(8)初次在单细胞分辨率将细胞周期与染色质状况联系了起来。研讨人员在每个单细胞文库中加入了等量的 lambda DNA,经过基因组测序读数和 lambda DNA 测序读数之间的份额精确推断出每个单细胞的倍性和细胞周期期间。该研讨运用小鼠胚胎干细胞研讨中已有的染色质优先仿制和后续仿制区域作为参照,发现这些区域在小鼠着床前胚胎发育进程中仿制先后顺序和胚胎干细胞中一起,阐明小鼠着床前胚胎在体内发育进程中和胚胎干细胞运用了根本一样的一组 DNA 仿制开始位点。

图 6: 小鼠着床前胚胎 DNA 甲基化和染色质重塑特征示意图

该研讨在国际上首先开发了对同一个单细胞能够一起研讨其染色质状况、核小体定位、DNA 甲基化、基因组拷贝数变异、以及染色体倍性 5 个层面的单细胞多组学测序技能,并初次运用该技能对小鼠着床前胚胎发育的 7 个要害期间进行了全基因组水平、单细胞分辨率、单碱基精度的表观基因组研讨,并深度解析了爸爸妈妈源基因组在着床前胚胎发育中 DNA 甲基化和染色质状况的重编程进程。该研讨体系地描写了高度特化的配子在受精后重编程到具有发育全能性的受精卵、以及进一步发育成多能性胚胎的进程中, DNA 甲基化和染色质状况发作的精准、有序的改变,以及各个组学层面之间的互动联系(图 6)。该工作为往后大家持续研讨哺乳动物前期胚胎细胞全能性和多能性的敞开奠定了根底,一起为体细胞克隆功率的进步以及前期胚胎发育反常的确诊与医治供给了新思路。

北京大学生命科学学院 BIOPIC 基地的博士后郭帆博士(现为四川大学研讨员)、博士生李琳、李静云为该论文的并列第一作者;北京大学生命科学学院汤富酬研讨员和四川大学郭帆研讨员为这篇文章的一起通讯作者。该研讨工作由北京大学和四川大学一起协作完结,而且得到了国家自然科学基金委员会、北京将来基因确诊高精尖立异基地,以及北大 - 清华联合基地的赞助。




(公帅男编辑《丿乱世丶名流站队》2020年04月04日 01:19 )

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